Uma das técnicas ópticas para microplaca mais sensíveis das disponíveis atualmente é a fluorescência resolvida no tempo (ou TRF, na sigla em inglês). Nessa técnica, utilizam-se fluoróforos especiais, que formam quelatos com metais específicos da família dos lantanídeos: Samário (Sm), Európio (Eu), Térbio (Tb), Disprósio (Dy). Esse método é muito utilizado em conjunto com a técnica de FRET, ou seja, como TR-FRET (para saber mais sobre o FRET tradicional, veja nosso artigo: a fluorimetria e suas aplicações)

A sensibilidade do TRF ocorre porque esses quelatos emitem a luz vagarosamente (na ordem de milissegundos) após a excitação, ao contrário dos fluoróforos tradicionais, cujo ciclo excitação-emissão ocorre na ordem de nanossegundos. Isso permite que a leitura seja realizada depois do pico de qualquer outra fluorescência tradicional, minimizando ao máximo o ruído do background da leitura. Para compensar o fato de não realizar a leitura durante o pico de emissão, no TRF utiliza-se uma janela de medição, ou seja, várias leituras ao longo de um período que serão integradas para formar o sinal real da leitura, como mostrado da Figura 1.

Como funcionam esses quelatos?

A técnica de TRF trabalha com quelatos ou criptatos de lantanídeos. Esses compostos são formados pela associação dos metais em forma iônica com compostos orgânicos capazes de gerar a interação dos lantanídeos com moléculas a serem marcadas, bem como promover a estabilidade do sinal fluorescente desses lantanídeos. Veja na Figura 2 alguns exemplos de quelatos e criptatos.

Ensaios de TRF homogêneo

Esse tipo de ensaio é utilizado para estudar interações proteína-proteína e proteína-DNA, detecção de marcadores secretados, modificação de proteínas e clivagem de proteínas. Suas vantagens incluem praticidade operacional, por utilizar método mix-and-measure, sem necessidade de passos de lavagem e, portanto, facilmente automatizado.

O HTRF é um tipo de TR-FRET criado pela Cisbio e extremamente sensível. Ele necessita de um equipamento compatível para sua leitura. O Varioskan LUX, leitor multimodal da Thermo Scientific é certificado nessa compatibilidade em seus modelos com leitura de TRF.

A figura abaixo mostra um exemplo de TR-FRET homogêneo para quantificação de uma proteína alvo que carrega a molécula doadora utilizando um anticorpo específico acoplado a um fluoróforo para TRF. Ao ocorrer a aproximação das duas partes, a intensidade da luz emitida por esse último será proporcional à concentração da proteína de interesse.

Ensaios de TRF heterogêneo

Nos ensaios heterogêneos, utilizam-se compostos imobilizados na placa ou a superfície de células aderentes como base sólida. O nome comercial dos TRFs heterogêneos é DELFIA® (imunoensaio de fluorescência de lantanídeo intensificado por dissociação), patenteada pela PerkinElmer, e podem ser utilizados para ensaios enzimáticos, ligação de receptores, citotoxicidade, ensaios multiplex (até 4 labels), entre outros.

Embora necessitem de passos de lavagem, os ensaios de TRF heterogêneos trabalham com alta faixa dinâmica e funcionam bem para uma grande variedade de matrizes, trazendo a praticidade de raramente precisar de diluição de amostras ou retrabalho em sua análise.

Em todo esse contexto, sabemos que o TRF é uma técnica robusta, reprodutível e extremamente sensível, apresentando diversas possibilidades de ensaios para o usuário. Se você tiver qualquer dúvida ou quiser mais informações, fique à vontade para acionar nossa equipe de assessoria científica. Estamos à disposição para auxiliá-lo.