Datamed

Atenção! Produtos FANEM apenas para o estado de Minas Gerais

Meu pedido R$0,00
0
0
Subtotal: R$0,00
Não há produtos no pedido.
0
0
Subtotal: R$0,00
Não há produtos no pedido.

A Fluorimetria e suas Aplicações

Jellyfish close-up. Isolated on a black background.

Nos últimos anos os ensaios de fluorescência têm se tornado mais variados e acessíveis, e o uso da fluorimetria no Brasil cresceu a passos largos. Essa técnica é, em média, mil vezes mais sensível do que a fotometria, feito alcançado principalmente por sua inerente seletividade.

Compostos fluorescentes, ou fluoróforos, são moléculas capazes de, ao absorverem a luz de uma determinada cor (comprimento de onda), emitem luz em uma cor diferente e de menor energia (maior comprimento de onda). Essa diferença entre o comprimento de onda da luz emitida e o da luz de excitação ocorre porque a molécula perde energia em formas como aumento de vibrações e rotações antes que a luz seja irradiada.

A seleção do comprimento de onda é realizada tanto para a luz de excitação (que irá incidir sobre a amostra) quanto para a luz emitida para otimizar o sinal captado pelos sensores de um fluorímetro, instrumento utilizado para os ensaios de fluorimetria.

Figura 1. O processo de fluorimetria em um fluorímetro

Uma característica importante do processo de fluorescência é que a luz emitida é proporcional à concentração do fluoróforo naquela solução. Isso significa que podemos realizar ensaios quantitativos de alta sensibilidade e seletividade.

Filtros versus Monocromadores

A seleção do comprimento de onda pode ser feita utilizando filtros ou monocromadores. Os filtros selecionam um comprimento de onda específico quando um raio de luz os atravessa, enquanto o monocromador é capaz de “abrir” a luz branca (geralmente gerada por uma lâmpada de xenônio) como um prisma.

Como o monocromador é instalado sobre um pivô, o equipamento é capaz de rotacioná-lo para que a cor de interesse seja direcionada por um orifício e, só então, incida sobre a amostra, como esquematizado na Figura 2. Assim, é possível selecionar qualquer comprimento de onda dentro do espectro contido na luz branca da lâmpada de xenônio, tipicamente de 200 a 1000 nm.

No caso da fluorescência, essa seleção de comprimento de onda também precisa ser realizada após a emissão de luz pela amostra, gerando um par: comprimento de onda de excitação/comprimento de onda de emissão.

Figura 2. Funcionamento de um monocromador

Cada método possui seus prós e contras. Filtros possuem comprimentos de onda virtualmente fixos, e se você precisar de um comprimento de onda diferente, terá de adquirir novos filtros, ou selecionar ensaios que possam utilizar os filtros que você já possui.

Já os monocromadores geram a chamada luz esparsa, que é um background de outros comprimentos de onda que acabam refletindo nas paredes do compartimento do monocromador e passando pelo orifício junto da cor que foi selecionada. Na fotometria esse efeito não afeta o ensaio, já que eles não são tão sensíveis assim, mas na fluorimetria isso se torna um problema, que costuma ser corrigido pela utilização de um segundo monocromador, que realiza novamente a seleção, diminuindo a luz esparsa a níveis que não afetarão a análise.

O que é e para que serve a leitura por baixo na fluorescência?

A leitura de fluorescência em microplacas é realizada tipicamente por cima da placa, utilizando placas pretas opacas para evitar que a luz emitida atravesse de um poço para o outro (efeito chamado cross-talk). Porém, quando trabalhamos com células aderentes, esse método não funciona tão bem e torna-se mais vantajoso realizar a leitura por baixo da placa. Para isso, utilizam-se placas pretas com fundos ópticos transparentes tratados, para que a cultura já seja feita ali.

Uma função interessante que surge ao se utilizar a leitura por baixo é a varredura de poço, ou leitura multipoint. Nela, várias leituras são realizadas em pontos diferentes do poço, o que é muito útil para culturas celulares, que podem se distribuir de forma heterogênea pelo fundo da placa. Assim, é possível obter mapas de calor da distribuição de fluorescência pelo poço, para depois obter a média ou integral desses sinais.

Figura 3. Leitura de fluorescência por cima (A) e por baixo (B) de um poço.

Quais compostos fluorescentes são utilizados?

O fluoróforo mais utilizado hoje é a GFP (Green Fluorescence Protein), isolada no início dos anos 1960 a partir de águas vivas do atlântico norte. Desde então, algumas variações da GFP foram produzidas utilizando engenharia genética, como a CFP e YFP (que fluorescem nas cores azul ciano e amarelo, respectivamente). Hoje, diversas variações dessas proteínas são produzidas, de acordo com ensaios específicos para os quais foram projetadas.

Outra forma muito útil de se utilizar a GFP é acoplar sua sequência gênica à sequência de uma proteína-alvo cuja expressão será analisada e inseri-la na célula por transfecção. Assim, quando a proteína-alvo for produzida, a GFP também será, e de forma proporcional. Medindo então a intensidade de fluorescência da GFP, podemos quantificar a mudança na expressão do gene analisado. Esse tipo de ensaio é chamado reporter gene, ou gene repórter.

Figura 4. Esquema do funcionamento de ensaios tipo gene repórter.

Outras aplicações

Ensaios de citotoxicidade

Marcadores de fluorescência podem ser utilizados em ensaios de citotoxicidade. Um marcador comum é o Calcein AM, da Thermo Scientific, que fora do ambiente celular com metabolismo ativo é um composto não fluorescente, mas é convertido em um composto de fluorescência verde (excitação em 485 nm e emissão em 528 nm) ao interagir com esterases no citoplasma de uma célula viva.

Assim, é possível realizar um ensaio semelhante ao MTT, na fotometria. Para mais informações sobre esse ensaio, veja nosso artigo: Fotometria Básica com a Datamed.

Quantificação de ácidos nucleicos

A diferença de sensibilidade na quantificação de ácidos nucleicos entre os métodos por absorbância e por fluorescência é gritante. A fluorescência, por utilizar não apenas fluoróforos, mas compostos que de fato se ligam à dupla ou simples fita é capaz de diferenciar com precisão entre proteínas, DNAds, DNAss e RNA. Assim, temos alta repetibilidade e seletividade, além de até 10 mil vezes mais sensibilidade, permitindo análises confiáveis quando falamos, por exemplo, de ensaios de expressão gênica. Esse tipo de quantificação também é utilizado muito frequentemente para preparo de soluções para sequenciamento.

Conheça mais sobre os benefícios dessa técnica com o reagente picogreen, da Thermo Scientific, utilizado nos kits Quant-iT, que permitem a quantificação de até picogramas de ácidos nucleicos.

Ensaios de fluxo de cálcio

Ensaios de fluxos de cálcio são comuns por detectar a mobilização de cálcio intracelular e sua subsequente liberação para o citoplasma. A movimentação de cálcio intra e intercelular é de extrema importância em um organismo, participando de diversos processos como contração muscular, coagulação e interação sináptica, sendo especialmente importante como indicador da função mitocondrial.

O estudo de sinalização celular também está intimamente ligado a ensaios de fluxo de Ca2+, estando disponíveis uma série e fluoróforos que interagem com o cálcio para os mais diferentes estudos, sejam eles qualitativos ou quantitativos.

Fluorescência por transferência de energia ressonante (FRET)

O FRET é uma técnica que utiliza a fluorescência para estudar interações moleculares em situações como dobramentos de proteína, mecanismos enzimáticos, ancoragem de proteínas e clivagem de peptídeos.

Seu funcionamento se baseia na transferência de energia de um fluoróforo doador que ao ser excitado causa a fluorescência de um aceptor. Esses fluoróforos são proteínas cuja sequência gênica é inserida junto ao gene das proteínas de interesse para que estejam na mesma macromolécula.

A fluorimetria nos trouxe um mundo de novas possibilidades no contexto das análises ópticas, seja em microplacas ou microscópios. Se você tiver qualquer dúvida ou quiser mais informações, fique à vontade para acionar nossa equipe de assessoria científica. Estamos à disposição para auxiliá-lo.

Compartilhar este post

Carrinho de compras