A luminescência é o fenômeno da produção de luz a partir de uma reação química (quimiluminescência) ou biológica (bioluminescência). Por isso, ela se difere de outros métodos ópticos por não utilizar uma luz de excitação. Uma consequência disso é a inexistência de background de autofluorescência da placa, soluções e amostras, o que resulta em menor ruído na leitura e um sinal mais claro e limpo. Por isso, a luminescência é capaz de ser até mil vezes mais sensível do que a fluorescência e um milhão de vezes mais sensível do que a absorbância.
Ensaios de luminescência são extremamente abundantes em ambientes de análise clínica. Isso porque, além da sensibilidade, esses ensaios são em sua maioria homogêneos, não exigindo passos de lavagem e por isso sendo facilmente automatizados. Mas além dessas aplicações, a luminescência pode ser usada para ensaios de gene repórter, ROS (Reactive Oxygen Species), citotoxicidade, viabilidade celular, monitoramento de micoplasma, ELISA quimiluminescente, entre outros.
Um luminômetro é um instrumento relativamente simples. Como dissemos, não há necessidade de incidir luz sobre a amostra, então também não há seleção de comprimento de onda de excitação. Além disso, na emissão, quando há apenas uma reação de luminescência ocorrendo, também não há necessidade de seleção do comprimento de onda, já que há apenas uma fonte de luz e toda a luz captada pelo sensor pertence ao comprimento de onda emitido pela amostra.
Apenas em ensaios do tipo dual (ou duplex) será necessário um filtro ou monocromador, pois nesses ensaios duas reações, emitindo luz em comprimentos de onda diferentes, estão ocorrendo. Nesses casos um filtro é necessário para selecionar um dos comprimentos de onda, enquanto a luz emitida pelo outro pode ser obtida deduzindo a luz medida após o filtro da luz total, obtida sem o filtro.
As placas utilizadas em ensaios de luminescência são, tipicamente, brancas e opacas. Isso permite que a luz seja refletida nas paredes do poço, a fim de direcioná-las para cima, na direção do detector. Apesar disso, alguns ensaios de sinais mais altos podem ser realizados em placas pretas.
Quais reações são utilizadas para luminescência?
Embora moléculas pequenas sejam utilizadas em algumas aplicações, a grande maioria dos ensaios de luminescência utiliza reações catalisadas por uma enzima, muitas vezes a luciferase de vagalume, para quebra de um substrato específico que é adicionado antes da leitura. Dependendo dessa enzima, a reação pode ser do tipo flash, com um sinal intenso que dura poucos segundos, ou do tipo glow, um sinal um pouco mais fraco que dura de minutos a horas. No caso das reações do tipo flash, costuma ser necessária a presença de um injetor automático, que irá dispensar automaticamente o substrato em cada poço para que o equipamento realize a medida em seguida, sem perder o pico de luminescência.
Outras aplicações
Ensaios duais de gene repórter
Esses ensaios, muito utilizados para estudar a regulação gênica, são uma versão mais rigorosa dos ensaios tradicionais de gene repórter com fluorescência (para saber mais sobre isso, veja nosso artigo Fluorimetria e suas aplicações), no sentido de que dois genes serão transcritos gerando duas enzimas de luminescência, sendo uma relativa ao gene estudado e outra funcionando como um normalizador. Tipicamente, a luciferase de vagalume é utilizada para o gene estudado e a luciferase de corais do gênero Renilla como referência.
Esse processo de normalização diminui a variabilidade do ensaio, principalmente quando se considera o fato de que ambos os genes foram inseridos nas células por transfecção.
Ensaios de ROS
A sigla ROS significa espécies de oxigênio reativo (Reactive Oxygen Species, em inglês), como H2O2, OH– ou O2- que ocorrem em uma solução ou cultura celular. Essas espécies são formadas principalmente durante a respiração aeróbia, e podem trazer diversos danos à célula se não forem reduzidas por enzimas ou antioxidantes e sua produção está intimamente ligada a processos como sinalização celular, senescência celular e apoptose.
Muitas espécies de oxigênio reativo são convertidas em H2O2 durante seu processamento, além disso, essa é uma espécie mais estável e com mais mobilidade dentro da célula do que as anteriores e, por essas razões, é um bom indicativo de estresse oxidativo, e por isso os ensaios de ROS geralmente identificam H2O2.
ELISA quimiluminescente
Muito parecida com sua versão tradicional, o ELISA quimiluminescente segue o mesmo processo de um ELISA, por exemplo, sanduíche: ligação do antígeno na placa sensibilizada, ligação do anticorpo secundário e revelação. A diferença é que agora a revelação é feita com uma enzima e substrato que irão gerar a luminescência em vez de uma reação que gera um cromóforo.
As vantagens principais do ELISA quimiluminescente são a sensibilidade e a ampla faixa dinâmica, ou seja, é capaz de identificar baixas e altas concentrações sem necessidade de diluições.
Um bom exemplo de utilização do ELISA quimiluminescente é a quantificação acurada de biomarcadores metabólicos – como insulina, pro-insulina, glucagon e peptídeo-C.
A luminescência é uma técnica de alta sensibilidade, já utilizada amplamente em análises bioquímicas. Hoje, temos testes comerciais robustos e também a possibilidade projetar seus próprios ensaios de acordo com os reagentes e sequências gênicas disponíveis no mercado. Como sempre, se você tiver qualquer dúvida, fique à vontade para acionar nossa equipe de assessoria científica. Estamos à disposição para auxiliá-lo.
