A tecnologia Alpha (amplified luminescent proximity homogeneous assay) utiliza beads em ensaios homogêneos para estudar interações entre biomoléculas e, por ser extremamente sensível, pode utilizar quantidades mínimas de amostra, chegando a apenas 5 µl em ensaios padrão e 1 µl em ensaios miniaturizados. A técnica Alpha é utilizada principalmente para screening de compostos no setor de life sciences, além de interações entre proteínas, epigenética, detecção de biomarcadores e sinalização celular.
Diferente de ELISAs e alguns ensaios quimiluminescentes, não há necessidade de passos de lavagem nem separação das moléculas com interações específicas e não-específicas.
Um ensaio clássico utilizando a tecnologia Alpha trabalha com duas beads (uma doadora e uma aceptora) que irão se ligar a anticorpos que por sua vez irão interagir com a molécula ou complexo molecular estudado. A proximidade das beads ao participarem do mesmo complexo molecular permite a formação de um sinal quimiluminescente, que será identificado pelo equipamento de leitura que possua um módulo de detecção Alpha. Nessa tecnologia há dois tipos principais de ensaio: AlphaScreen e AlphaLISA.
O ensaio AlphaLISA
Os ensaios de AlphaLISA seguem uma sequência padrão, que mostramos abaixo.
1. Adicionar a amostra.
2. Adicionar anticorpos biotinilados e as beads aceptoras, ligadas a anticorpos que irão interagir com um epítopo (sítio de ligação) diferente dos anticorpos biotinilados.
3. Ambos anticorpos se ligam à molécula alvo.
4. Adicionar as beads doadoras ligadas a estreptavidina, que irão se ligar aos anticorpos biotinilados.
OBS: O par estreptavidina e biotina possui tão alta afinidade entre si que, estando presentes em um mesmo ambiente, irão necessariamente se ligar.
5. Ao excitar a bead doadora com luz a 680 nm, esta irá produzir oxigênio singleto, que irá viajar até a bead aceptora e iniciar uma reação quimiluminescente, gerando luz entre 520 e 620 nm.
O ensaio AlphaScreen
A técnica de AlphaScreen é muito similar à AlphaLISA, porém utilizamos outras formas de interação que não anticorpos, chamadas tags.
Em um teste de interação proteína-peptídeo, por exemplo, o peptídeo poderia ser biotinilado, e a proteína ligada a estreptavidina. Assim, cada bead seria marcada com seu par respectivo, se ligado ao peptídeo ou proteína de estudo. Uma vez que haja interação entre eles, as beads estarão próximas, sendo possível gerar o sinal como descrito para o AlphaLISA.
Exemplos de ensaios
Ensaio AlphaScreen para AMP cíclico
Nesse ensaio o cAMP endógeno é biotinilado, e em seguida identificado utilizando uma bead doadora revestida de estreptavidina e a bead aceptora conjugada a um anticorpo anti-cAMP.
Ensaios AlphaLISA duplex: proteínas e fosforilação
Utilizam-se duas beads aceptoras: uma para se ligar à proteína alvo e outra para se ligar ao grupo fosfato. Assim, é possível identificar proteínas fosforiladas (estarão ligadas às duas beads aceptoras) e não fosforiladas (apenas uma bead aceptora estará ligada).
A tecnologia Alpha é jovem, mas robusta. Sabemos que com o tempo diversas novas aplicações irão surgir e ampliar sua utilidade. Se você tiver qualquer dúvida ou quiser mais informações, fique à vontade para acionar nossa equipe de assessoria científica. Estamos à disposição para auxiliá-lo.
