Nos últimos anos os ensaios de fluorescência têm se tornado mais variados e acessíveis, e o uso da fluorimetria no Brasil cresceu a passos largos. Essa técnica é, em média, mil vezes mais sensível do que a fotometria, feito alcançado principalmente por sua inerente seletividade.

Compostos fluorescentes, ou fluoróforos, são moléculas capazes de, ao absorverem a luz de uma determinada cor (comprimento de onda), emitem luz em uma cor diferente e de menor energia (maior comprimento de onda). Essa diferença entre o comprimento de onda da luz emitida e o da luz de excitação ocorre porque a molécula perde energia em formas como aumento de vibrações e rotações antes que a luz seja irradiada.

A seleção do comprimento de onda é realizada tanto para a luz de excitação (que irá incidir sobre a amostra) quanto para a luz emitida para otimizar o sinal captado pelos sensores de um fluorímetro, instrumento utilizado para os ensaios de fluorimetria.

Uma característica importante do processo de fluorescência é que a luz emitida é proporcional à concentração do fluoróforo naquela solução. Isso significa que podemos realizar ensaios quantitativos de alta sensibilidade e seletividade.

Filtros versus Monocromadores

A seleção do comprimento de onda pode ser feita utilizando filtros ou monocromadores. Os filtros selecionam um comprimento de onda específico quando um raio de luz os atravessa, enquanto o monocromador é capaz de “abrir” a luz branca (geralmente gerada por uma lâmpada de xenônio) como um prisma.

Como o monocromador é instalado sobre um pivô, o equipamento é capaz de rotacioná-lo para que a cor de interesse seja direcionada por um orifício e, só então, incida sobre a amostra, como esquematizado na Figura 2. Assim, é possível selecionar qualquer comprimento de onda dentro do espectro contido na luz branca da lâmpada de xenônio, tipicamente de 200 a 1000 nm.

No caso da fluorescência, essa seleção de comprimento de onda também precisa ser realizada após a emissão de luz pela amostra, gerando um par: comprimento de onda de excitação/comprimento de onda de emissão.

Cada método possui seus prós e contras. Filtros possuem comprimentos de onda virtualmente fixos, e se você precisar de um comprimento de onda diferente, terá de adquirir novos filtros, ou selecionar ensaios que possam utilizar os filtros que você já possui.

Já os monocromadores geram a chamada luz esparsa, que é um background de outros comprimentos de onda que acabam refletindo nas paredes do compartimento do monocromador e passando pelo orifício junto da cor que foi selecionada. Na fotometria esse efeito não afeta o ensaio, já que eles não são tão sensíveis assim, mas na fluorimetria isso se torna um problema, que costuma ser corrigido pela utilização de um segundo monocromador, que realiza novamente a seleção, diminuindo a luz esparsa a níveis que não afetarão a análise.

O que é e para que serve a leitura por baixo na fluorescência?

A leitura de fluorescência em microplacas é realizada tipicamente por cima da placa, utilizando placas pretas opacas para evitar que a luz emitida atravesse de um poço para o outro (efeito chamado cross-talk). Porém, quando trabalhamos com células aderentes, esse método não funciona tão bem e torna-se mais vantajoso realizar a leitura por baixo da placa. Para isso, utilizam-se placas pretas com fundos ópticos transparentes tratados, para que a cultura já seja feita ali.

Uma função interessante que surge ao se utilizar a leitura por baixo é a varredura de poço, ou leitura multipoint. Nela, várias leituras são realizadas em pontos diferentes do poço, o que é muito útil para culturas celulares, que podem se distribuir de forma heterogênea pelo fundo da placa. Assim, é possível obter mapas de calor da distribuição de fluorescência pelo poço, para depois obter a média ou integral desses sinais.

Quais compostos fluorescentes são utilizados?

O fluoróforo mais utilizado hoje é a GFP (Green Fluorescence Protein), isolada no início dos anos 1960 a partir de águas vivas do atlântico norte. Desde então, algumas variações da GFP foram produzidas utilizando engenharia genética, como a CFP e YFP (que fluorescem nas cores azul ciano e amarelo, respectivamente). Hoje, diversas variações dessas proteínas são produzidas, de acordo com ensaios específicos para os quais foram projetadas.

Outra forma muito útil de se utilizar a GFP é acoplar sua sequência gênica à sequência de uma proteína-alvo cuja expressão será analisada e inseri-la na célula por transfecção. Assim, quando a proteína-alvo for produzida, a GFP também será, e de forma proporcional. Medindo então a intensidade de fluorescência da GFP, podemos quantificar a mudança na expressão do gene analisado. Esse tipo de ensaio é chamado reporter gene, ou gene repórter.

Outras aplicações

Ensaios de citotoxicidade

Marcadores de fluorescência podem ser utilizados em ensaios de citotoxicidade. Um marcador comum é o Calcein AM, da Thermo Scientific, que fora do ambiente celular com metabolismo ativo é um composto não fluorescente, mas é convertido em um composto de fluorescência verde (excitação em 485 nm e emissão em 528 nm) ao interagir com esterases no citoplasma de uma célula viva.

Assim, é possível realizar um ensaio semelhante ao MTT, na fotometria. Para mais informações sobre esse ensaio, veja nosso artigo: Fotometria Básica com a Datamed.

Quantificação de ácidos nucleicos

A diferença de sensibilidade na quantificação de ácidos nucleicos entre os métodos por absorbância e por fluorescência é gritante. A fluorescência, por utilizar não apenas fluoróforos, mas compostos que de fato se ligam à dupla ou simples fita é capaz de diferenciar com precisão entre proteínas, DNAds, DNAss e RNA. Assim, temos alta repetibilidade e seletividade, além de até 10 mil vezes mais sensibilidade, permitindo análises confiáveis quando falamos, por exemplo, de ensaios de expressão gênica. Esse tipo de quantificação também é utilizado muito frequentemente para preparo de soluções para sequenciamento.

Conheça mais sobre os benefícios dessa técnica com o reagente picogreen, da Thermo Scientific, utilizado nos kits Quant-iT, que permitem a quantificação de até picogramas de ácidos nucleicos.

Ensaios de fluxo de cálcio

Ensaios de fluxos de cálcio são comuns por detectar a mobilização de cálcio intracelular e sua subsequente liberação para o citoplasma. A movimentação de cálcio intra e intercelular é de extrema importância em um organismo, participando de diversos processos como contração muscular, coagulação e interação sináptica, sendo especialmente importante como indicador da função mitocondrial.

O estudo de sinalização celular também está intimamente ligado a ensaios de fluxo de Ca²⁺, estando disponíveis uma série e fluoróforos que interagem com o cálcio para os mais diferentes estudos, sejam eles qualitativos ou quantitativos.

Fluorescência por transferência de energia ressonante (FRET)

O FRET é uma técnica que utiliza a fluorescência para estudar interações moleculares em situações como dobramentos de proteína, mecanismos enzimáticos, ancoragem de proteínas e clivagem de peptídeos.

Seu funcionamento se baseia na transferência de energia de um fluoróforo doador que ao ser excitado causa a fluorescência de um aceptor. Esses fluoróforos são proteínas cuja sequência gênica é inserida junto ao gene das proteínas de interesse para que estejam na mesma macromolécula.

A fluorimetria nos trouxe um mundo de novas possibilidades no contexto das análises ópticas, seja em microplacas ou microscópios. Se você tiver qualquer dúvida ou quiser mais informações, fique à vontade para acionar nossa equipe de assessoria científica. Estamos à disposição para auxiliá-lo.